بررسی بیماری سندرم برگ زردی نیشکر(YLS) تهیه و تنظیم حسین موذن رضامحله

مقدمه:

نيشكر گياهي گرمسيري و از خانوادة غلات مي باشد و در حال حاضر بيش از چندين هزار رقم نيشكر بصورت تجاري در جهان مورد استفاده قرار مي گيرد. امروزه توليد قند و شكر و فرآورده هاي جانبي از نيشكر براي كشورهاي توليد كننده آن از اهميت اقتصادي بسزايي برخوردار است به طوريكه حدود 62 درصد شكر توليدي در جهان از نيشكر بدست مي آيد. از نيشكر علاوه بر شكر فراورده هاي جانبي فراواني از قبيل ملاس و باگاس نيز بدست مي آيد كه از ملاس در صنايع الكل سازي، دارو سازي و رنگ سازي استفاده مي شود و از باگاس در كارخانجات كاغذ سازي، پنيرسازي و توليد خوراك دام استفاده مي گردد.

با توجه به استعداد بالقوه خوزستان در كشت نيشكر و براي نيل به خود كفايي در زمينة قند و شكر و بهره برداري از صنايع جانبي آن علاوه بر كشت و صنعت هاي هفت تپه و كارون ، طرح عظيم ملي در جهت توسعه كشت نيشكر در سطحي بيش از 84000 هكتار در نواحي شمالي و جنوبي اهواز در هفت واحد در دست اجرا بوده که بیش از50000 هکتار آن به بهره برداري رسيده است. لذا با توجه به افزايش سطح كشت و با توجه به اهميت اقتصادي نيشكر شناخت و مبارزه با عوامل محدود كننده محصول آن يك ضرورت مي باشد. يكي از فاكتورهاي بسيار مؤثر در كاهش محصول نيشكر بيماريهاي آن مي باشد. از بيماريهاي مهم نيشكر بيماری (yellow life syndrum) yls (سندرم برگ زردی )  با دو عامل بیــماریزا است كه بر روي گونه هاي مختلف نيـشكر و هيبريد هاي آن خسارتی به طور متوسط  20 درصد و در رقمSP71-6163  در برزيل 30-25 درصد گرديده است.

تاريخچه:

بيماري yls یک بیماری نسبتا جدید نیشکر بوده و اولین بار در سال 1989 گزارش گردید و در سال 1991 توسط Fors در ونزوئلا گزارش شد ، در طي سالهاي 1992-1991 در برزيل ظاهر گرديد و در سال 1996 در ايالات متحده امريكا (فلوريدا، لوئیزيانا و تگزاس)، استراليا، آفريقاي جنوبي و فرانسه بررسي شد.

در طي چهار دهه گذشته، عوامل زنده و غير زنده متعددي در ارتباط با اين بيماري شناسايي شده و تحت عناوين مختلف به شرح زير معرفي شدند.

 

1-yellow wilt in Africa (Ricaud /1968./Siddiki/1969./Rogors/1970).

2-Autumn declin in Brazil(Hughes/1964./Mastsuoka et al./1997).

3-No pathogens were associated

«علائم بيماري»

علائم بيشتر در گياهان بالغ و بصورت زردي سطح زيرين رگبرگ اصلي  مشاهده مي گردد و در ارقام حساس اين زردي پخش شده و پهنك برگ را فرا مي گيرد.

                                        

 مشاهده علائم بیماری با درجات متفاوت در گیاهان آلوده به فرم ویروسی این بیماری ناشی از تنوع ژنتیکی آن می باشد. اثر Finger print مربوط به توالی ویروسی در رقمهای مختلف آلوده به scylv، نشان می دهد که در توالی (sequence) ویروسscylv در مناطق جغرافیایی متفاوت، اختلاف وجود دارد. زرد شدن رگبرگ اصلي بيشتر در رگبرگهاي برگهاي سوم تا ششم گياه (از بالا به طرف پايين) مشاهده مي شود. در بعضي واريته ها در برگهاي مسن، سطح پايين رگبرگ اصلي زرد بوده و سطح بالايي ممكن است سفيد يا سفيد متمايل به سبز يا قرمز باشد. مثلا در رقم SP71-6163 قرمزي واضحی را در سطح فوقاني رگبرگ اصلي مي بينيم در حاليكه سطح زيرين رگبرگ اصلي كاملا زرد مي باشد. در اثر انسداد آوندهاي چوبي و آبكش درساقه، آب واملاح و مواد غذايي در برگ تجمع یافته و انتقال شیره پرورده از برگها از طریق آبکش کاهش می یابد و Brix(مواد جامد قابل حل) عصاره رگبرگ اصلی افزایش می یابد بطوریکه  Brix  از مقدار کمتر و مساوی 7 در گیاهان سالم به 3-2 برابر درگیاهان آلوده افزایش می یابد، میانگره های انتهایی کوتاه شده و دراثرتجمع ساکارز (دی ساکارید= قند نیشکر) برگهای انتهایی زرد می شوند و نکروزه شدن از نوک برگ شروع می گردد. در آفریقا علائم از غبغب (Dewlap) اولین برگ مشاهده گردیده است. این بیماری باعث ضعیف شدن و کاهش توسعه سیستم ریشه و نکروزه شدن آن می گردد.

در اثر این بیــــــماری ساقه نیـــــــشکر ضعیف شده که زمینه حمله قارچهـــای ساپروفـــــ,یتی چون sacchari  Marasmios، حشرات فرصــت طلب مثل سخت بالپــــوش Xyleborus offinis را فراهم می کند. خسارت در ساقه ارقام خیلی حساس بصورت کمرنگ شدن و ایجاد ســوراخ و توخالی شدن نمایان می گردد.

    

نسبت جوانه زنی و رشد اولیه گیاهان فاقد عامل بیماری (ویروس) به وضوح بیشتر از گیاهان آلوده بوده، بیوماس) Biomass (کلی و وزن ساقه رسیده بطور متوسط در نمونه های عاری از ویروس بیشتر می باشد.

 اثر بر فتوسنتز:

    میزان فتوسنتز در برگهای گیاهان بدون ویروس هم در غلظت پایین و هم در غلظت بالای  co₂ بیش از 20 درصد نسبت به گیاهان آلوده بیشتر بوده و ضریب هدایت روزنه ای برگهای آلوده پایین تر از برگهای عاری از ویــــروس می باشد. دراپیـــدرم پایینی برگهــــای آلوده روزنه ها بوســــیله مواد توپــــی شکـل  (superficial bodies)تغییر شکل داده و در نهایت بسته میشوند در حالیکه روزنه های برگهای سالم کاملا مشخص و باز می باشند.

سلولهای مزوفیل بین رگبرگها در برگهای آلوده تغییرات معناداری ندارند، گر چه لایه ضخیمی از مواد بی شکل مشابه موم(wax)از بافت زیر اپیدرمی بطرف نواحی عمیقتر متمایل گردیده است . در برگهای آلوده به سندرم برگ زردی، آوندهای چوبی بزرگ بوسیله مواد بی شکل و زاید پر میشوند و گاهی اندامکهای مدور مشابه فیتوپلاسما میتوانند فضاهای بین سلولی Bundle sheath cells را پر کند در حالیکه آوند چوبی اولیه در برگهای سالم خالی میباشد.

مقدار کلروفیل در هر دو جمعیت گیاهی آلوده و سالم یکسان و برابر nmol/mm   0.42بوده ولی نسبت کلروفیل a به کلروفیل b در گیاهان آلوده تغییر می کند، یعنی کاهش کلروفیل a و افزایش جبرانی کلروفیل b در گیاهان آلوده باعث کاهش معنی دار نسبت کلروفیل a به b (2.57) در مقایسه با گیاهان عاری از ویروس (3.09) میگردد. بنابراین افزایش سطح کربوهیدرات برگها، کاهش کلروفیل a در مقایسه با کلروفیل b ، کاهش ظرفیت فتوسنتزی و کاهش رشد در گیاهان آلوده دلالت می کند که scylv اثرات زیان آوری برروی انتقال شیره پرورده حتی در برگهای سبز دارد و باعث کاهش وزن ساقه های رسیده می گردد. اثر scylv روی میزان رشد، تجمع بیوماس (Biomass) بعد از استقرار و رشد گیاه، زیاد نبوده و بیشترین اثر scylv، برروی شوت یا گیاهچه جوان هم در مرحله جوانه زنی و هم در مرحله پنجه زنی می باشد.Herbers  و همکاران در سال 1997 نشان دادند که ویروس عامل بیماری، یک پروتئین حرکتی تولید می کند و وجود آنرا از طریق PLRV ثابت کرده اند. این پروتئینهای حرکتی از طریق روزنه های پلاسمودسماتا می توانند از سلولی به سلول دیگر حرکت کنند که از این طریق بر روی رشد ساقه اثر می گذارند.

کاهش ظرفیت فتوسنتزی گیاه و کاهش انتقال محصولات فتوسنتزی به عوامل متعدد گیاهی و محیطی نیز وابسته است. رشد گیاه بوسیله فاکتورهای زنده و غیرزنده بطور شدیدی ممکن است محدود شود و قابل تفکیک از  بیماری scylv نباشد، فاکتورهایی چون خشکی، کمبود مواد غذایی مثل نیتروژن، درجه حرارت پایین، انتقال شیره پرورده را محدود می کنند(همانند اثر scylv) که جهت تفکیک می توانیم نسبت کلروفیل a/b را تعیین نموده که در صورت کاهش این نسبت، علائم حاصله ناشی از  بیماری scylv می باشد حتی زمانی که برگها کاملا سبز باشند و مقدار کلی کلروفیل در گیاهان آلوده و سالم نزدیک هم باشند ، کاهش نسبت a/b در اثر بیماری scylv صورت می گیرد.

اگر کاهش درجه حرارت، عامل زردی رگبرگ اصلی باشد(10-7درجه سانتیگراد) با افزایش دما زردی حاصل از سرمااز بین می رود(بر خلاف بیماری ناشی از yls). ضمنا قابل انتقال بودن عوامل ویروسی و فیتوپلاسمایی بوسیله ناقلین عامل تفکیک کننده دیگری از عوامل فیزیکی می باشد.

عامل بیماری:

1. در سال 1980 دو پاتوژن جداگانه از سندرم برگ زردی (yls)جداگردید.

ویروس برگ زردی نیشکر              sugarcane yellow leaf virus) scylv   

فیتوپلاسمای زردی نیشکر            sugarcane yellow  phytoplasma            

در آفریقا فرم scyp غالب است در حالیکه در سایر نقاط جهان از جمله ایران فرم scylv غالب است.                                                                               

الف) : scylv  بیشتر در ساقه های رسیده و قابل آسیاب دیده می شود(نوک ساقه در مقایسه با پایه) این ویروس در همه ساقه های حاصل از یک طوقه (stool) آلوده وجود دارد. قطر ویروسهای scylv در فسفوتنگستات سدیم (sodium phosphotungstate) در ph=5 ، 29-24 نانومتر و چگالی شناور آن gr/cm 30/1 در cs₂so₄ و ژنوم آن ssRNA با وزن  Kb8/5 می باشد و دارای پروتــــئین کپسید غیر گلیـــــکوزیدی با توده مولکولی KDa27 بوده و از نظر سرولوژی و بیولوژیکی از اعضای دیگر خانواده   Luteoviridae  مجزا می باشد.

سنجش پروتئینی ژنوم scylv بوسیله (RT-PCR) و با استفاده از پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی مخصوص لوتئوویروس به این نتیجه منتهی می شود که scylv یک عضو قطعی جنس Luteovirus می باشد. جهت کسب اطلاعات بیشتر از ترادف و توالی نوکلئوتید ژنوم scylv  به تعیین وابستگی و خویشاوندی این ویروس با سایر لوتئوویروسها نیازاست.

Scylv از نظر سرولوژیکی به(Barly yellow dewarf virus)BYDV-RPV وابسته است وگزارش شده که پارتیکل های شبه لوتئوویروس در تجمع با yls از نظر سرولوژیکی به BYDV-RPV  وابسته است از طرفی scylv توسط Melanaphis saccharid وRhopalosiplum maidis از نیــــشکر به یــــولافAvena sativa که حساسیت بالایی به آلودگی (BYDV) دارد، انتقال پیدا نمی کند، بنابراین نتیجه می گیریم که scylv وBYDV از نظر بیولوژیکی، لوتئوویروسهای مجزا با درجه محدودی از وابستگی آنتی ژنی می باشند. سه جنس  Enamovirus ,Polerovirus ,Luteovirus در خانواده Luteoviridae  وجود دارد. اخیراً آزمایشات ژنومی مشخص کرده که ویروس  scylvیک ویروس نوترکیب از اجداد سه جنس ویروس بالا و عضو برجسته جنس جدید Saccharvirus می باشد.

ب) SCYP :

در افریقا این عامل غالب است. طبق رده بندی Lee et al  که بر اساس آنالیز RFLP می باشد سه گروه فیتوپلاسمایی 1و  3و 4 و یک زیرگروه به شرح زیر شناسایی شده است :

1- گروه یک: European aster yellow 1-B   

2- گروه سه:Western X ш-A   یا Peach yellow leaf roll ш-A  

3- گروه چهار:Coconut lethal yellow V-A

4- زیرگروه Tomato big bud 1-Aکه مشابه گروه یک است.

نتایج اولیه آنالیز توالی ژنومی فیتوپلاسما در هـاوایـی بـیان می کند که   scypعضـو گـروه western x می باشند و اگرچه مدارک خوبی جهت ارتباط عامل  فیتوپلاسمایی  scypبا علائم yls در فقدان scylv وجود دارد ولی هنوز هیچ مدرکی مبنی بر اینکه scyp یک پاتوژن مهمی برای نیشکر باشد وجود ندارد.

گاهی اوقات با وجود عامل فیتوپلاسمایی در گیاه به دو دلیل  شاهد فقدان علائم می باشیم :

1-غلظت پایین فیتوپلاسما که نمی تواند باعث ایجاد خسارت در کلروپلاست شود هرچند که حساسیت بالای پرایمر Nested PCR غلظت خیلی پایین فیتوپلاسما را آشکار می کند.

2- شرایط محیطی نامطلوب جهت رشد و تکثیر فیتوپلاسما.

  توزیع جغرافیایی بیماری:

این بیماری در 39 کشور از جمله ایران و کشورهایی چون آرژانتین، استرالیا، کلمبیا، کوبا، اکوآدور، السالوادر، گوآتمالا، هاوایی، هند ،کنیا، جامائیکا، مکزیک، نیکاراگوئه، چین، پرو، سنگال، تایلند، آمریکا(فلوریدا-لوئیزیانا)،ونزوئلا، با عامل ویروسی و در کشورهای آفریقای جنوبی ، کنیا، موزامبیک، اوگاندا، زامبیا، زیمباوه، مالاوی ، موریتانی با عامل فیتوپلاسمایی گزارش گردیده است.

 

«روش انتقال»

هر دو شکل yls (فرم ویروسی و فرم میکو پلاسمایی) از طریق قلمه های آلوده و حشرات تغذیه کننده شیره گیاهی به نواحی جدید پراکنده می شوند و بصورت مکانیکی و بذرمنتقل نمی گردند. در فرم میکوپلاسمایی  علاوه بر انتقال بوسیله قلمه و گیاه انگلی سس، توسط زنجره Perkinsiella saccharicida بصورت     Propagative (تکثیری) صورت می گیرد و تحقیقاتی که در طی سالهای  2003- 2001 در مزارع نیشکر آلوده به yls در کوبا صــــــورت گرفت مشـــــــخص شد که در بعــــــضی از مزارع که زنجره saccharosydne  saccharivora با جمعیت بالا وجود دارد، وقوع yls در همان مزارع افزایش یافته است و ترادف  sequence  space region(sr) بین فیتوپلاسمای عامل yls و زنجره فوق الذکر دارای تــشابه 99-89 درصد می باشد، بنابراین احتمال داده می شود که این زنجره نیز ناقل فرم فیتوپلاسمایی yls باشد.

در فرم ویروسی شته های Melanaphis sacchari (شته نیشکر) و Rhopalosiphum maidis (شته ذرت) و R. rufiabdominalis (شته ریشه برنج) ناقل می باشند (انتقال نیمه پایا) ولی شته دیگر نیشکر sipha flova که ناقل ویروس موزائیک نیشکر(SCMV) از Potyvirus است ناقل ویروس scylv نمی باشد و M. sachari قادر به انتقال ویروس موزائیک نیشکرنیست.

میزبانها:

میزبانهای scylv رنجی از ژرم پلاسم نیشکر شامل  saccharum sinensis s. spontaneum, s.robustum, s. officinarum و گندم، یـولاف، جـو،Erianthus ، برنـج و ذرت بـوده کـه توســط M. sacchari آلوده می شوند، اما بوسیله R. maidis ویروس به ذرت، یولاف، سورگوم و جانسون گراس منتقل نمی شود.

میزبـانـهای scyp-yls عـلاوه بر نیـشکر گـیاهـانی چـون نــــــارگـیل و Bermuda grass (cynodon dactylon) که در حاشیه مزارع نیشکر یافت می گردد می باشند.

 

 

رقم های حساس به yls در کشور های مختلف از جمله ایران :

Brazil: SP71-6163,SP71-1406, SP71-6180.

Colombia: CC84-75, CC87-434, CC85-96, V71-51.

Cuba: C87-51, C1051-73, C120-78.

Ecuador: B7316

El Salvador: CP72-1210, PR68-3120, PR77-3313, PR87-2084.

Florida (USA): CP72-1210, CP81-2149, CP88-769.

Guatemala: SP70-1284, CP72-2086, CP72-1210.

Iran:CL54-405, CP63-588, CP73-21, CP65-357.

Mauritius: M292/70, M695/69, Q72, CP72-1210.

México:CP72-2086, Mex57-473, CP72-1210, Co997.

Texas (USA): CP86-1644, CP87-1733.

Venezuela: V71-51, PR 69-2176.

 

«تشخیص عوامل ایجاد کننده بیماری»

چون فرمهای scyv-yls و  scyp-yls از نظر علائم شبیه هم هستند واز طرف دیگر فاکتورهای محیطی اثر زیادی در بیان علائم دارند، در نتیجه نمی توان از طریق مشاهده علائم ظاهری عامل بیماری را تعیین کرد و  

 خالص سازی scylv از گیاهان آلوده به دلیل محدود بودن ویروس به سلولهای آوند آبکش و مقدار کم آن مشکل می باشد.

شناسایی این ویروس هم از طریق روشهای مولکولی و هم از طریق روشهای سرولوژیکی صورت می گیرد. اگرچه روشهای مولکولی از دقت بیشتری نسبت به روشهای سرولوژیکی برخوردار می باشند ولی استفاده از آنها در مقیاس وسیع جهت تشخیس خیلی گران می باشد. معمولا ویروس در یک سوم بالایی ساقه آلوده تمرکز بیشتری دارد و این قسمت مکان خوبی برای استخراج ویروس می باشد، جاییکه گلوکز و فروکتوز در سطح بالایی قرار دارد و ساکاروز در حال جمع شدن می باشد. این میانگره ها در مقایسه با بافت میانگره های پیر فعالیت متابولیکی شدیدتری دارند و درآینده باید روی موضوع تجمع ساکاروز در میانگره ها و ارتباط آن با حضور scylv تحقیقات وسیعتری صورت گیرد.

اگر یک stool آلوده شود ویروس بزودی در تمام ساقه ها پراکنده شده بنابراین می توان انتظار داشت که ویروس محدود به آوند آبکش است و سیستم آوندی ســــــاقه های مختلف در داخل یک stool بهم پیوسته می باشد.

ابتدا ساقه ها را از برگها و پوشالها پاک نموده وسر نی ها را جدا کرده و دور می ریزند. با استفاده از یک دستگاه پانچ کوچک از هر میانگره از بالاترین قسمت سوراخ ایجادکرده و حداقل 500ml عصاره استخراج می کنند و در داخل لوله های تمیز Eppendorf می ریزند از محل دیگری از همان میانگره نمونه گیری صورت گرفته و این دو را با هم مخلوط می کنند تا یک نمونه ترکیبی حاصل شود. سپس لوله ها در r/min14000 به مدت دو دقیقه سانتریفیوژ می شوند و از آن برای تست الیزا استفاده می گردد.

از روشهای دیگر روش Tissue-blot که در ایستگاههای قرنطینه ای استفاده می شود و به دلیل قیمت بالای کاغذ نیتروسلولز و آنتی سرم، روش دقیق و گرانی می باشد. ابتدا روی کاغذ نیتروسلولز آنتی سرم می ریزیم، سپس ساقه را پرینت می کنیم هر کجا مثبت بود نقاط سیاه مشاهده می شود که نشانه وجود بیماری است.

  روش تعیین بریکس(Brix)  رگبرگ اصلی:

ابتدا عصاره رگبرگ اصلی زرد شده آلوده به yls را با یک وسیله مکانیکی استخراج کرده سپس با استفاده از دستگاه  Reflactometerمقدار Brix را قرائت می کنند که اگر بیش از 7 باشد آلوده به yls می باشد.

 بطور کلی روشهای تشخیص ویروس yls به شرح زیر می باشد:

1.ISEM/(Immuno absorbent electron microscopy)

2.ELISA/(Enzyme-linked immunosorvent assay)

3.TBIA(Tissue-blot immuno assay)

4.RT-PCR/(Reverse Transcription Polimerase chain Reaction)

5.Purification of the causal agent

6.Brix determinationin the midrib

                                 

اگر عامل yls-scyp باشد، تشــخیص با استفاده از میکروسکوپ الکترونی و انجام تست PCR(polymerase chain rection) از ناحیه  16 and 23srDNA (بر اساس توالی ژنوم فیتوپلاسما حمله کننده)  ژنوم فیـــــــتوپلاســـــما و انــــــجام تست(Restriction Fragment Length Polimorphism )RFLP بر روی تولیدات حاصله از PCR صورت می گیرد.

 

YLS و کمبود آهن و سرما :

رگبرگ اصلی درعارضه کمبود آهن سبز ولی در  ylsزرد است و در کمبود آهن پهنک برگ بصورت متناوب و موازی خطوط زرد و سبز دارد.

 مبارزه:

اگر عامل ویروسی باشد:

1-  استفاده از قلمه های عاری از ویروس با استفاده از ترموتراپی و کشت مریستم انتهایی:

 ترموتراپی(Hot Water) بطور وسیع به منظور حذف پاتـوژنهای سیستمیک از قـلمه های نـیشکر استفاده می شود ولی استفاده ازآن جهت مبارزه با پاتوژنهای ویروسی محدود به ویروس موزائیک نیشکر می باشد و در درمان قلمه های آلوده به scylv موفقیت آمیز نبوده است ولی ترکیب تیمار(Hot Water) و کشت بافت مریستم در حذف ویروس موفقیت آمیز است که روش پرهزینه ایست و احتیاج به زمان زیادی دارد.

2- استفاده از واریته های مقاوم و متحمل (ارقام مقاوم:H78-3567, H78-4153,H78-7750 )

3- برداشت سریع واریته های زود رس با مشاهده علائم

4- حذف استرس های خشکی با آبیاری منظم

5- حذف ماندابی ناشی از زهکشی نامناسب

6- استفاده از مواد مغذی شیمیایی (کود)به منظور غنی سازی خاک

اگر عامل SCYP باشد:

تاکنون برای حذف پاتوژن SCYP روشی شناسایی نشده است. ولی معمولا استراتژیهای کنترلی بر اساس عوامل اپیدمیولوژی(ناقلین و دامنه میزبانی)صورت می گیرد.

 

این مقاله را تقدیم به استاد و دوست بزرگوارم جناب آقای( دکتر آنتونیو چینه آ مارتین) از کشور کوبا تقدیم می نمایم.

  

                                                              پایان

 

 

 

 

 

Refrences:

1 -Moutia,j.F.Y.,Saumtally,S.2001.Diagnosis of sugarcane yellow leaf virus in cane suice and the effect of hot water treatment on its control. Pages  444-449 in : I4th Internatinal society of sugar cane technologists .D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organizing committee  publishing . Australia.

2 -smith,G.R.,Braithwaite, K.S,and cronje,C.P.R.2001.the viral and phytoplasma forms of yellow leaf syndrome of sugarcane .Pages,14-17 in :24 th International society of sugarcane technologists.D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organing committee publishing.Australia.

 

3- Lockhart,BenE.and cronje,Pieter R.1999yellow leaf syndrome.Pages 291-295 in A guide to sugarcane disease.Philippe Rott,Roger A.Bailey,Jack C.Comstock,Barry J.Croft. ISSCT  Publishing Co.

 

4- Grisham,M.P.,pan,Y-B.,Legendre,B.L.,Godshall,M.A.,andEggleston, G.2001  .Efect of sugarcane yellow leaf virus on sugarcane yield and juice quality . Pages 634-637 in:24th Internatinal society of sugar cane technologists .D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organizing committee  publishing . Australia.

 

5- Leherer,A.,Meinzer, R.,Moore,P.,and Komor,E . 2001.Physiological consequences of sugarcane yellow leaf virus infection on the sugarcane plant Pages 654-659 in:24th Internatinal society of sugar cane technologists .D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organizing committee  publishing . Australia.

 

6- Chatenet,M.,Delage, C.,Ripolles, M.2001.Detection of sugarcane yellow leaf virus in quarantine and production of virus-free sugarcane by Apical Meristem culture. Plant Disease 85:1177-1180.

7- Abdelmajid,N.,A.Mohamed,P.Cronje and P.Jones,1999.First report of yellow leaf syndrome of sugarcane in morocco.Plant-Disease83:398.

 

8- Arocha,Y.,E.L.Peralta,L.Gonzalez and P.Jones,1999.First report of a virus and a phytoplasma associated with sugarcane yellow leaf syndrome in cuba .Plant-Disease 83:1171

 

9- Comstock,J.C.,and Gilbert,R.T.2005. sugarcane yellow leaf disease.University of Florida.

 

10- Arocha,Y.,Lopez,M.,Femandez,M.,Pinol,B.,Horta,D.,Peralta,E.L,Almeid,R.     , Carvajal,O.,Picomell,S.,Wilson,M.R. and  Jones,P.2005.Transmisstion of a sugarcane yellow leaf phytopelasma by the  Delphacid planthopper saccharosydne  saccharivora,a new vector of sugarcane yellow leaf syndrome.plant pathology 54:634-642.

 

11- Schenek,S.,Advences in control of yellow leaf syndrome . 1997.Pathology report 67.Hawaii Agriculture Research Center.

 

12- Borg,Z.,Moonan,F.,Braithwaite,K.,Eric Mirkov, T. and Smith, G. 2001.characterising the genetic diversity of sugarcane yellow leaf virus. Pages 654-656 in:24th Internatinal society of sugar cane technologists .D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organizing committee  publishing . Australia.

 

13- Aljanabi,s.m.,Parmessur,Y.,jones,P.,Saumtally.,andDookun,A.2001.Detection and characterization of  sugarcane yellow phytoplasma. Pages 343-347 in : 24th Internatinal society of sugar cane technologists .D.M.Hogarth. the XXIV ISSCT Congress organizing committee  publishing . Australia.

14- Mansur Scagliusi,S., and lockhart,B.E.1999.Transmission, characterization, and serology of a luteovirus associated with yellow leaf syndrome of sugarcane. Phytopathology.90: 120-124.

 

 

 

 

 

 

بررسی بیماری کوتولگی نیشکر(RSD)-قسمت دوم(پایانی)

«عامل بیماری»

Steindl (1961) , Gillaspie , Davis and  Worley (1974)   تلاش هایی را جهت پیدا کردن عامل بیماری RSD انجام دادند و فرضیه ویروسی بودن عامل بیماری را مطرح نمودند و در سال 1973 باکتری کوچکی در ارتباط با RSD پیدا شد.

 عامل بیماری Clavibacter xyli subsp.xyli با نام جدید Leifsonia xyli subsp.xyli از باکتری های Coryneform بوده و اندازه آن µm 4-1 × 0.5 - 0.25 می باشد. از مشخصات اصلی این باکتری عبارتند از : هوازی، میله ای شکل، غیر متحرک، گرم مثبت، فاقد  اسپور، Non acid fast، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی و چند شکلی(polymorphism) باکتری در داخل عناصر آوندی چوبی گیاهان آلوده همراه با مواد زمینه (Matrix) مشاهده می شود. باکتری هم در سلول و هم در دیواره سلول آوندی وجود دارد. ترکیب سلول های باکتریایی و Matrix باعث بسته شدن آوند چوبی می شود، اگر این مواد مسدود کننده کشیده شود و یا از محل برش ساقه های آلوده فشار دهیم ممکن است در داخل ماتریکس میکروکلونی هایی از باکتری مشاهده شود. قطر کلونی mm0.3-0.1 ، گرد، حاشیه کلونی کامل، محدب و بدون پیگمانت (رنگدانه) می باشد.Kao and Damann در سال 1980 بافت نی آلوده را از طریق میکروسکوپ الکترونی مورد آزمایش قرار داده و باکتری را در آوندها، تراکئیدها، پارانشیم ها و منافذ آوند چوبی مشاهده کردند. این باکتری معمولا تک سلولی، گاهی دیواره دار و گاهی بصورت رشته های منشعب و یا میکروکلونی هایی که شامل سلولهای باکتریایی بهم پیوسته است، می باشد.

باکتری معمولا مستقیم یا میله ای با خمیدگی جزئی که بعضی از این سلول های باکتریایی در قسمت انتها یا میانی متورم می باشند. مزوزوم غالبا وجود دارد و در هنگام تشکیل دیواره عرضی ظاهر میشود.

 دامنه میزبانی :

گیاهان زیر میزبان این بیماری می باشند.

Echinochloa colona                                                             Zea mays

 Imperata cylindrica                                             Sorghum sudanensis

Panicum maximum                                                               Sorghum sp

Pennisetum purpureum                                                        Brachiaria mutica

Rhynchelytrum repens                                                         B. miliiformis

Sorghum verticiliflorum                                                       Chloris gayana

Sporobolus capensis                                                            Cynodon dactylon

«اپیدمیولوژی» 

1- در واریته های حساس پراکندگی و کلونیزه کردن بیماری بیشتر است.

2- خسارت در راتون ها بیشتر است.

3- استرس های رطوبتی باعث افزایش بیماری می شوند.

4- این بیماری با SCMV حالت سینرژیستی دارد.

5- انتشار بیماری از طریق:

 الف) قلمه های آلوده  ب) نی برهای آلوده در فصل برداشت  ج) تیغه های هاروستر و پلانتر  د) ابزارآلات کشاورزی در زمان حذف علف های هرز و کود دهی  ه) جوندگانی چون گاو، اسب، گراز ، موش، روباه و حیوانات دیگر.

6- علف های هرز دائمی با ریزوم های زیرزمینی همچون جانسون گراس   sorghum halepense می تواند به عنوان نگهدارنده (رزرو کننده) احتمالی پاتوژن عمل کند.

7- تا کنون گزارشی مبنی بر انتقال از طریق بذر و بقای باکتری روی خاک موجود نمی باشد.

« تکنیک های تشخیصی»

تشخیص RSD بدلیل نبود علائم خارجی در نیشکر، و علائم داخلی که در همه ارقام به اندازه کافی گسترش نیافته است، مشکل می باشد.

Ricaud در سال 1974 مسائل مربوط به  تشخیص RSD را مرور کرد و روشهای سرولوژیکی و میکروسکوپی را جهت تشخیص، مورد استفاده قرار داد.

تکنیک های تشخیصی عبارتند از :

1- juvenile symptom in cane

2- .mature symptomsin cane

3- inoculation of differential hosts

4- Fase contrast microscopy (PCM)

5- IIF (Indirect immunofluorescence)

6- DB-EIA(Dot blot enzyme immuno assay

7- EM(Electron microscopy)

8- EIM(Electron immuno microscopy)

9- STM(Staining by transpiration method)

                

تست های ایمنوشیمیایی:

1- TB-EIA(Tissue-blot enzyme immuno assay)

با این روش دستجات آوندی کلونیزه شده مشخص و قابل شمارش می باشند.

2- EB-EIA(Evaporative binding enzyme immuno assay)

یک روش الیزا تغییر یافته ای جهت آنالیز عصاره آوندی می باشد.

روش مولکولی:PCR

سنجش بر اساس ژنوم 16sRNA ریبوزومی پاتوژن صورت می گیرد.

 

جداسازی پاتوژن از نی های آلوده به RSD :

ابتدا نمونه های آلوده را از سطح مزارع جمع آوری می کنیم. این نی ها باید دارای میانگره های کوتاه و باریک بوده و جوانه هاي جا نبيshoot) ( Lateral نداشته باشند و فاقد آسیب های مکانیکی و آفات باشند. سپس محلول سافرانینo (5/2) درصد تهیه می کنیم(5/2گرم سافرانینo را در 100 میلی لـیتر الکتل اتیلیک96 درصد حـل می کنیم و با آب مقـطر به حجم یـک لیـتر می رسا نیم) و نی های آلوده را از محل طوقه بریده و در داخل محلول سافرانینo قرار می دهیم. بعد از یک تا دو ساعت، نی را به اندازه های مختلف بریده و وارد آزمایشگاه کرده و پس از تهیه کردن برش عرضی از میانگره های تحتانی و با استفاده از میکروسکوپ نوری (بزرگنمایی20) اقدام به تعیین دستجات آونـدی کلونیزه شـده و سـالـم می نماییم. با بـررسـی43 مـزرعـه از چـهار رقـم CP69-1062,CP57-614, SP70-1143,CP48-103 که توسط نگارنده در مزارع کشت و صنعت دعبل خزاعی صورت گرفت رقم CP69-1062 با میانگین 24 درصد انسداد دستجات آوندی آلوده ترین رقم و CP57-614 با میانگین 11.4 درصد دارای کمترین آلودگی بوده و دو رقم  SP70-1143 ,CP48-103 با میانگین درصدهای انسداد دستجـات آونـدی به ترتیب (16.9، 12.9) در رده های بعدی قرار گرفتند. به منظور جداسازی عامل بیماری، بعد از شستشوی سطحی ابتدا با الکل اتانول 70% ضدعفونی کرده سپس با استفاده از پانچ عصاره آن را گرفته و در محیط کشت اختصاصی کشت داده و دو تا چهار هفته در دمای 28 درجه سانتیگراد قرار می دهیم. دو هفته بعد کلونی هایی به قطر mm.0.3-0.1 ظاهر می شود.

       محیط کشت اختصاصیSC

Corn meal agar                                ۱۷gr-

Soytone or phyton                            8  gr

K₂HPo₄                                             1  gr

KH₂Po₄                                            1  gr

MgSo₄ .7H₂o                                    .2  gr

- Bovin Hemin Chlorid                      15 

-Ph                                               6.6-7.5

-Distilled water                                 1 lit

موادی که باید فیلتر شوند:

 Bovin serum albumin fraction five          2  gr               

  Glucose                                            0.5 gr                           -                            

  Cistein                                              0.5 gr

 

 

سنجش آلودگی از طریق juvenile symptoms :

قلمه های آلوده که فقط یک جوانه دارند به طول cm 8-5 در یک ظرف محتوی Vermiculite  کشت داده می شوند، بعد از چهار تا هفت هفته (در مرحله 5- 4 برگی) ساقه های جوان  بوسیله تیغ بصورت طولی برش داده شده و از نظر تغییر رنگ مورد آزمایش قرار می گیرند. چون ناحیه برش داده شده در معرض هوا به سرعت تیره می شود بررسی باید سریع صورت گیرد.

سنجش آلودگی از طریق Mature symptoms:

قلمه های آلوده که فقط یک گره دارند به طول cm 8-5 در یک ظرف محتوی Vermiculite  کشت داده می شوند، بعد از 6-2.5 ماه بوسیله تیغ ساقه ها برش داده می شوند. علائم در تمام گره های پایینی مشاهده میشود.

سنجش آلودگی از طریق  Inoculation of differential hosts:

این آزمون مستقیما بر روی Elephant grass، Bana grass و رقم Q28 نیشکر استفاده شد.

قلمه هایی با دو گره کشت داده شد، فقط گره پایینی که فاقد جوانه است و ریشه تولید میکند در خاک قرار می گیرد و گره بالایی شوت تولید می کند. دو تا پنج هفته بعد از کشت از طریق بریدن برگ های دوکی لوله شده شوت ها و آلوده کردن سطح بریدگی با عامل بیماری، به مدت یک روز سطح بریدگی را با فویل آلومینیوم پوشانده می شوند. یک تا دو هفته بعد یکی از شوت ها را برداشته و ناحیه گره پایینی را بطور طولی برش می دهیم تغییر رنگ دستجات آوندی برحضور بیماری دلالت می کند. فقط رقم های خاصی از Elephant   و Bana grass این علائم را تولید می کنند.

 کنترل:

الف – رعا یت اصول بهداشتی:

چون عامل باکتریایی RSD از طریق مکانیکی منتقل می شود همه سطوح برنده نی از قبیل قمه نی بر، کولتیواتور(ماشین شخم زنی و علف هرز کن) و تیغه های پلانتر(کشت کننده) و هاروستر(برداشت کننده) ممکن است آلوده شوند. تجهیزاتی که در مزارع آلوده مورد استفاده قرار می گیرند باید قبل از وارد شدن به مزرعه سالم از عصاره نی، خرده های نی و پوشال پاک شده و تیغه های ادوات باید توسط گرما(آب گرم ، بخار آب) یا ضدعفونی کننده های شیمیایی ضدعفونی گردند. مواد ضد عفونی کننده عبارتند از:

 1-محلول 15-5  درصد Lysol (محلول اسید کریسیلیک خنثی شده)

2-محلول 1 درصد Dettol (مخلوط روغن کاج و  پاراکلرومتوکسی لنول)

3- اتانول 50 درصد

4-میرول(Mirrol) 0.1 درصد

بHot water:

این روش اولین بار در سال 1960 در آمریکا استفاده شد و از آن تاریخ تا به امروز در بسیاری کشورها از جمله ایران استفاده می شود.

تیمار آب گرم (Hot water) معمول ترین روشی است که برای کنترل RSD استفاده می شود که شامل سه مرحله است:

1- ابتدا قطعات نی در یک محفظه آب( به نسبت 4 قسمت آب + 1 قسمت نی) به مدت 24 ساعت در دمای 45 درجه سانتیگراد  نگهداری می شود. بهتر است آب جریان داشته باشد و  در غیر اینصورت هر 12 ساعت آب باید تعویض شود.

2- بعد از مرحله اول نی ها همراه با سبدهای خود در محفظه دوم با دمای 50 درجه به مدت 2ساعت(52 درجه به مدت 30 دقیقه، 53 درجه به مدت 20 دقیقه)نگهداری می شوند.

3- بعد از مرحله دوم قلمه های نی همراه با سبدهای خود در محفظه سوم که دمای آب آن با دمای محیط یکسان است و حاوی قارچ کش است، به مدت 15-10 دقیقه نگهداری می شوند.

عمل موفقیت آمیز Hot water نه تنها  به فاکتورهای بیولوژیک بلکه به طراحی مهندسی و اعمال مناسب واحد گرما دهنده و سیستم کنترل دما و حجم مناسب و چرخش صحیح گرما و بارگیری مناسب نی در داخل قفسه ها بستگی دارد. در تیمار کردن قلمه های نی با آب گرم مرحله رشد نی باید در نظر گرفته شود، چونکه نی های رسیده بعد از Hot water در مقایسه با نی های نارس یا خیلی رسیده بهتر جوانه می زنند. برای افزایش توانایی جوانه زنی نی های جوان حساس به گـرما 5-1 روز به مدت 10 دقیقه در 50 درجه قرار داده و روز بعد به مدت 3-2 ساعت در 50 درجه قرار می دهیم.

 ج-Hot- air

قلمه های نی را در قفسه قرار داده و هوا باید بطور مساوی در بین آنها چرخش یابد. زمان لازم برای نفوذ دمای 58 درجه بمدت 8 ساعت و در دمای 50 درجه بمدت 24 ساعت می باشد. برای نفوذ بهتر هوای گرم درساقه و کاهش خطر آتش سوزی، تیمارهای نی باید عاری از برگ و غلاف باشند.

د-Moist-air :

این روش در هند معمول بوده و المنت های گرما دهنده را در داخل محفظه های موردنظر قرار داده وتمام روزنه ها بسته می شوند تا سطح رطوبت در کل محفظه ثابت نگه داشته شود و دما ظرف یک ساعت به 54 درجه می رسد و به مدت 7 ساعت نگه داشته می شود.

 ه-Aerated-steam :

در این روش بخار تحت تاثیر هوای گرم قرار گرفته و نی ها خیلی سریعتر گرم می شوند و دمای داخلی ساقه خیلی سریع به سطح مناسب می رسد. دمای 53 درجه بمدت 4 ساعت برای کنترل RSDتوصیه می شود.

و- استفاده از ارقام مقاوم:

رقم های مقاوم عبارتند از Q95،Q61، Q50، L60-25، CP63، CP52-68، CP29-116 و رقم خیلی مقاوم H60-6909.

ز- مبارزه شیمیایی:

حساسیت باکتری عامل بیماری به آنتی بیوتیک هایی چون  Vancomycin،  Erythromycin، Oleandomycin، Rifampicin ، Demeclocyeline، Chloramphenicol در شرایط آزمایشگاهی وجود دارد ولی در شرایط مزرعه ای تاثیر چندانی در کاهش علائم RSD ندارد.

                                                                                                                         Referencesمنابع:

1 -Gilaspie, jr., and Teakle, D. S. 1984. Ratoon stunting disease.pages 59-78 in: Disease of sugarcane:Majur Disease.C. Ricaud, B.T. Egan,A,G.Gillaspie, jr.,and C.G.Hughes,eds,Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,New York.

 

2-Hoy, J. W., Grishan, M. P.,  and Damann, K. E. 1999.Spread and increase of ratoon stunting disease of sugarcane and comparison of disease detection methods. Plant Dis .83:1170-1175.

 

3-Hideo, K.1988. sugarcane disease. A Guide for field identification food and agriculture organization of the United Nations  Rome.127pp.

 

4-Rott P.,J.C.Comstock,B.J.Croft,A.Kusalwoug,and S.Savmtally.2005.

Advences and Challenges in sugarcane pathology:A review of the 2003Pathology Workshop.607-614.

 

5-Davis, M. J. and Bailey, R.A. 2000. A guide to sugarcane disease. In : P.Rott,R. A. Bailey, J. C. Comstock, B. J. Croft and A.S.Saumtally, Editors.CIRID-ISSCT,339 PP.

 

6-Bailey, R. A. and McFarlaue, S. A. 1999. The incidence and effects of ratoon stunting disease of sugarcane in southern and central Africa.Proc.Intern.Soc.sugarcane.Tech.Vol 23:338-346.

 

7-Teakle, D. S. 1974. The causal agent of ratoon stunting disease.Proc.Intern.Soc.sugarcane Tech. 15: 813-826.

8-Davis, M. J. Dean, J. L., Miller, J. D. and Shine, J. M. 1994. A method to screenfor resistence to ratoon stunting disease of sugarcane, 6: 9-16.

 

9-Gillaspie, A.G., Davis, R. E. and Worley, J. E. 1974. Nature of the ratoon stunting disease agent. Proc.Intern.Soc.Sugarcane Tech. 15: 813-826.

10-Alexander, K.C. 1997. A special report on disease situation observed in the various areas visited between 15-61997 and immediate action needed.3pp. sugarcane development and by- production company,ahvaz.